21-03-2014, 08:27

Ботаническое описание. Однолетнее травянистое растение. Корень стержневой, ветвистый. Стебель прямостоячий, нередко от основания разветвленный, ребристый, покрытый железистыми волосками. Листья очередные, до 13 см длины, сидячие, стеблеобъемлющие. Цветки собраны в крупные корзинки, достигающие до 5 см в диаметре у немахровых и до 8 см у махровых форм, располагаются одиночно на концах стебля и его разветвлениях. Краевые цветки язычковые, средние, функционирующие как тычиночные, имеют оранжевый или желтый венчик. Плоды - серповидноизогнутые семянки, до 30 мм длины. Масса 1000 семян (семянок) 8...12 г. Цветет с июня до глубокой осени, плодоносит с конца июля.
Происхождение и распространение. В диком виде календула лекарственная произрастает в странах Средиземноморья, заходя на восток до Ирана. Широко культивируют во многих странах Европы, США. На территории России как декоративное и лекарственное растение можно выращивать повсеместно.
Химический состав. В цветочных корзинках содержатся каротиноиды и флавоноиды. В соцветиях календулы имеются также полисахариды, полифенолы, смолы (около 3,4 %), слизь (2,5 %), азотсодержащие слизи (1,5 %), органические кислоты.
Биологические особенности. В культуре возделывают махровую форму ноготков, у которой в зависимости от условий произрастания и размера посевного материала количество махровых цветков колеблется от 12 до 39 %. Размножение семенное. Всходы появляются на 6...12-й день после посева. Фаза бутонизации наступает через 20...25 дней после появления всходов, начало цветения - на 38...50-й день, созревание семян отмечается через 2...2,5 месяца. Систематическое и полное удаление соцветий обусловливает обильное цветение, заканчивающееся лишь к концу вегетационного периода. Даже частичное оставление цветков, на которых начинают образовываться семена, снижает формирование новых бутонов, а вместе с этим и урожайность. Семена начинают прорастать при температуре 2...4 °С. Всхожесть семян сохраняется в течение 3...5 лет.
Возделывание.
В культуре ноготки не требовательны к почвам, но лучше растут на влажных, открытых солнечных участках. Размещать их можно в севооборотах (в полях с одно- или двулетними культурами) и на запольных участках. Лучшие предшественники - оборот пласта многолетних трав, а также раноубираемые пропашные культуры и озимые зерновые.
Сорта. На сегодняшний день существует большое разнообразие сортов календулы, особенно зарубежной селекции. Ho специально для получения лекарственного сырья отечественными селекционерами были выведены сорта Кальта и Рыжик.
Рыжик. Сорт выведен в BHKAPe методом индивидуальносемейственного отбора из возделываемой популяции. Высота растений 50...90 см, цветение продолжительное - 80... 100 дней. Длина вегетационного периода (от всходов до созревания семян) 160...170 дней. Урожайность 10 ц/га воздушно-сухих соцветий. Урожайность семян 4 ц/га. Сорт в слабой степени поражается мучнистой росой и вредителями. Характеризуется оранжево-желтыми соцветиями, небольшой ярусностью соцветий, удобен для механизированной уборки. Сорт включен в Государственный реестр в 1981 году.
Кальта. Сорт селекции ВИЛАР. В слабой степени поражается болезнями и вредителями, в отдельные годы поражается мучнистой росой. Сорт превосходит сорт Рыжик крупностью и махровостью соцветий, имеет более густую окраску венчика. Высота растений составляет от 50 до 80 см. Урожайность от 8 до 22 ц/га воздушно-сухих соцветий. Содержание каротиноидов в соцветиях варьирует от 105 до 405 мг %, изменяясь по годам и в пределах фазы цветения в зависимости от погодных условий. Включен в Государственный реестр в 1984 году, в настоящее время широко возделывается в стране.
Календулу не рекомендуется выращивать на одном месте в течение нескольких лет. Это приводит к истощению почвы, усиливается поражаемость растений болезнями и вредителями. При возделывании календулы как монокультуры, урожайность ее на каждый последующий год падает на 10...25 %
Подготовка почвы - общепринятая для зоны возделывания: вслед за уборкой предшественника проводят лущение, а спустя 10... 12 дней - зяблевую вспашку на глубину 25...27 см.
Удобрение. Для обеспечения обильного и длительного цветения ноготков необходимо усиленное азотное и фосфорное питание. Осенью под зяблевую вспашку вносят до 40 т навоза на 1 га. Совместно с семенами высевают до 40 кг на 1 га гранулированного суперфосфата. При хорошей заправке почвы с осени подкормки не проводят.
Посев. Высевают ноготки одновременно с ранними яровыми культурами. Для посева используют крючкообразные мелкие семена, учитывая, что при этом легче выдержать норму посева, а также и то, что такие семена дают больше махровых соцветий. Норма посева 10 кг на 1 га семян 1-го класса, глубина посева 2...4 см, ширина междурядий 45 см.
Уход. Оптимальная густота стояния 15...20 растений на 1 м, что достигается заданной нормой посева. Уход за плантациями заключается в проведении 2-3 междурядных рыхлений, 1-2 ручных прополок (при использовании гербицидов их исключают). Для борьбы с сорной растительностью применяют гербицид трефлан, который вносят до посева культуры с заделкой в почву в дозе 4 кг на 1 га.
Уборка. К уборке цветков приступают с самого начала цветения. Распустившиеся соцветия собирают (срывая у самого основания) вручную в фазе раскрытия не менее половины язычковых цветков у махровых форм. В первый период цветения соцветия собирают через 3 дня, позже - через 4-5 дней. За сезон цветки убирают до 20 раз.
Ручной сбор позволяет полностью собирать соцветия. Это важно, так как даже частичное образование семян на растении вызывает резкое снижение урожайности соцветий и завершение вегетации растения.
Механизированную уборку соцветий затрудняет расположение соцветий на неодинаковой высоте (от 30 до 70 см), растянутый период цветения и неравномерность распускания соцветий. Из-за этого разработанные календулоуборочные машины очесывающего типа (УCK, PM-1,4, ОС-2,8, чехословацкая VZR-4) вместе с соцветиями удаляют часть бутонов, что сокращает количество механизированных уборок до 4-5 раз за сезон и снижает урожайность. В собранный ворох попадают также листья и стебли, соцветия с остатками цветоносов длиннее допустимых пределов, часть соцветий остается неубранными. Получаемое при этом сырье требует ручной доочистки или сортировки на машинах грохотного типа.
Собранные цветки сушат на воздушных сушилках, крытых токах. Лучшим способом сушки, с точки зрения быстроты и сохранения качества сырья, является искусственная сушка на сушилках типа СПК, СЛТ-150, а также на каркасных сушилках с использованием воздухоподогревателей ВПТ-400, ВПТ-600 при температуре до 45 °С. Сушка считается законченной, когда при нажатии пальцами соцветие распадается.
Урожайность воздушно-сухих цветков при полном сборе составляет 10...18 ц с 1 га.
Хранение. Сырье хранят в штабелях на стеллажах. Вид упаковки оказывает существенное влияние на содержание и стабильность биологически активных веществ сырья календулы. При использовании полиэтиленовых мешков срок хранения и содержание БАВ снижается.
По стандарту сырье должно быть упаковано в ящики из листовых древесных материалов не более 20 кг нетто, в ящики из гофрированного картона или в бумажные многослойные мешки не более 6 кг нетто.
Срок годности сырья составляет 2 года.
Семеноводство. Семенные участки закладывают семенами семеноводческой элиты или первой репродукции, выращиваемыми в научных учреждениях или на экспериментальных базах ВИЛАР. Размер семенного участка 5 % от товарной плантации. Пространственная изоляция не менее 50 м. На семенных участках с самого начала цветения удаляют все растения с не оранжево-красными цветками, а также с мелкими корзинками.
Урожайность семян 4-6 ц с 1 га.
Числовые показатели качества сырья. Качество сырья цветков ноготков регламентируется ГФ XI, вып. 2, ст. 5 «Цветки ноготков» и включает следующие числовые показатели: экстрактивных веществ, извлекаемых 70 % спиртом, не менее 35 %, влажность не более 14 %, золы общей не более 11 %, остатков цветоносов, в том числе отделенных от корзинок при анализе, не более 6 %, корзинок с полностью осыпавшимися язычковыми и трубчатыми цветками (цветоложе с обвертками) не более 20 %, побуревших корзинок не более 3 %, других частей растения (кусочков стеблей и листьев) не более 3 %, органической примеси не более 0,5 %, минеральной примеси не более 0,5 %
Применение. Препараты календулы ускоряют процессы регенерации тканей, ускоряют рост и улучшают качество грануляций, способствуют более быстрой эпителизации и формированию более нежного рубца. При применении внутрь препараты календулы также проявляют свою противовоспалительную активность, способствуют регенерации слизистых оболочек желудка и кишечника, заживлению язв и эрозий.
Препараты календулы лекарственной применяют для полоскания полости рта и горла при ангинах и стоматитах, для лечения ожогов, длительно незаживающих ран, язв, свищей, а также язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, гастритах, болезней печени.

При рассмотрении язычковых цветков с поверхности видны удлиненные клетки эпидермиса с оранжевыми округлыми хроматопластами (рис. 8), трубка венчика густо опушена простыми и железистыми одно-двухрядными волосками; завязь также опушена: с выпуклой стороны железистыми, по краям вогнутой стороны - простыми двухрядными волосками (рис. 9).

Рисунок 8 . Хромопласты календулы лекарственной

Рисунок 9 . Железистые волоски календулы лекарственной

Микроскопический анализ листа шалфея лекарственного

На микропрепарате листа с поверхности видны следующие микроскопические признаки: круглые железки, характерные для семейства губоцветных (рис. 10), а также многочисленные простые многоклеточные волоски (рис. 11).

Рисунок 10. Железки шалфея лекарственного

Рисунок 11. Простые многоклеточные волоски

Микроскопический анализ цветков ромашки лекарственной

На микропрепарате цветков ромашки аптечной видны друзы оксалата кальция в мезофиле.

Рисунок 12. Друзы оксалата кальция ромашки лекарственной

Микроскопический анализ травы череды трехраздельной

При микроскопическом исследовании поверхностного среза диагностическое значение имеют простые волоски с толстыми стенками и продольной складчатостью кутикулы, встречающиеся по всей пластинке (рис.13).

Рисунок 13. Простые волоски череды трехраздельной

Микроскопический анализ эвкалипта прутовидного

На микропрепарате листа с поверхности эвкалипта прутовидного видны многоугольные клетки эпидермиса, в центре которых видны светло-серые пятна.

Рисунок 14. Клетки эпидермиса эвкалипта прутовидного

Вывод по главе: при изучении сбора были выявлены диагностические признаки для каждого компонента сбора. Таким образом, макро- и микроскопический анализ показал присутствие в сборе цветков ромашки лекарственной, корней солодки голой, листьев шалфея лекарственного, листьев эвкалипта прутовидного, цветков календулы лекарственной, травы череды трехраздельной, тем самым подтвердили подлинность компонентов сбора.

Список литературы

1. Атлас лекарственных растений. М.: ВИЛАР 2006, с.270-271.

2. Аминокислотный и моносахаридный состав листьев шалфея лекарственного / О.Н. Кошевой // Химия природных соединений. – 2011. - № 3. – с. 435 – 436.

3. Багрий А. К., Курмаз Б. В., Литвиненко В. И. Новый биозид кверцетина // Химия природных соединений. - 1996.- № 2.- С. 85–90.

4. Бахтимирова, Л.В. Особенности распределения флавоноидов в сырье календулы лекарственной / Л.В. Бактимирова // Вопр. биологич. мед. и фармац. химии. – 2013. - № 15. – 31 с.

5. Большая российская энциклопедия лекарственных средств: в 2 т. / под ред. Ю.Л. Шевченко [и др.]. – М.: Ремедиум, 2001. - 2 т.

6. Ботаника. / Под ред. Яковлева В.А., Челомбитько В.А. – М. 1990. – 680 с.

7. Бурбелло, А.Т. Современные лекарственные средства: Клинико-фармакологический справочник практического врача // А.Т. Бурбелло, А.В. Шабров, П.Л. Денисенко. – СПб.: Нева, 2005. – 896 с.

8. Википедия [Электронный ресурс],-Режим доступа: http://ru.wikipedia.org/wiki

9. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырьё / МЗ СССР. – 11 изд. – М.: Медицина, 1990 .– Вып. 2. – 367 с.

10. Государственная фармакопея Российской Федерации / Издательство «Научный центр экспертизы препаратов медицинского применения». – М., 2008. – 543с.

11. Государственная фармакопея Российской Федерации / Издательство «Научный центр экспертизы препаратов медицинского применения». –М., 2008. – 704с.

12. Государственный реестр лекарственных средств. – [Электронный ресурс], – Режим доступа: http://www. grls.rosminzdrav.ru

13. Гринкевич, Н.И. Химический анализ лекарственных растений / Н.И. Гринкевич, Л.Н Сафронич. – М., 1984. – 162 с.

14. Землинский С.Е. Лекарственные растения СССР – М.: Медгиз, 1958 – 260-261 с.

15. Календула лекарственная: Аналитический обзор / Б.М. Зузук, Р.В. Куцик, С.М. Калугина и др.// Провизор. – 2001. - № 5. – 29-34 с.

16. Куркин, В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов / В.А. Куркин. – Самара: ООО «Офорт», ГОУВПО «СамГМУ», 2004. - 1180 с.

17. Лекарственные растения: Календула лекарственная. – [Электронный ресурс],- Режим доступа: http://medicalherbs.sci-lib.com

18. Машковский, М. Д. Лекарственные средства / М. Д. Машковский – М.: Новая волна, 2007.– 1107 с.

19. Муравьёва, Д.А. Фармакогнозия: учебник / Д.А. Муравьёва, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. М.: Медицина, 2002. – 656 с.

20. Оленников, Д.Н. Новые гликозиды изорамнетина и другие фенольные соединения Calendula officinalis / Д.Н. Оленников, Н.И. Кащенко // Химия природных соединений. – 2013. - № 5. – 717 – 723 с.

21. ОСТ 91500.05.001-00. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения. – Введ. 01-03-2000. – М., 2000. – 34 с.

22. Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб: ОФС 42-0013-03. Взамен ГФ XI, вып. 1, ст. 267.

23. С какой целью в фармацевтической практике используют корни солодки / Н.В. Иващенко // Фармация. – 2002. – Т. 51, № 3. – с. 35.

24. С.Я. Соколов, И.П. Замотаев. Справочник по лекарственным растениям. М.: «Медицина». 1988, с. 208-211.

25. Соколов С.Я. Фитотерапия и фитофармакология. – М., 2000. – 967 с.

26. Состав и биологические свойства полифенолов череды трехраздельной / А.С.Микаэлян, Э.Т. Оганесян, Э.Ф. Степанова, А.В. Крикова // Фармация. – 2008. - № 1. – С. 33-35.

27. Турищев, С.Н. Практика лечения растениями: Краткое справочное пособие / С.Н. Турщев. – М.: Фармединфо, 1993.

28. ФитоТерапевт: Ромашка лекарственная. – [Электронный ресурс],- Режим доступа: http://www.fito-terapevt.ru/matricaria-chamomilla

29. Шарова, О.В. Флавоноиды цветков календулы лекарственной / О.В. Шарова, В.А. Куркин // Химия растительного сырья. – 2007. - №1. – 65-68 с.

30. Энциклопедический словарь лекарственных растений и продуктов животного происхождения / под ред. Г.П. Яковлева, К.Ф. Блиновой. – СПб.: СпецЛит, издательство СПХФА, 2002. – 407 с.

31. Яковлева Г.П., Блинова К.Ф. Фармакогнозия. – СПб. "Медицина". - 2004. - 756с.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Ноготков лекарственных цветки ФС. 2.5.0030.15

С alendulae officinalis flores Взамен ФС 42-0168-06

(изм. № 3 от 2.09.1999)

Собранные в начале распускания трубчатых цветков и высушенные цветочные корзинки культивируемого однолетнего травянистого растения ноготков лекарственных (календулы лекарственной)  Calendula officinalis L., cем. астровых – Asteraceae .

ПОДЛИННОСТЬ

Внешние признаки. Цельное сырье. Цельные или частично осыпавшиеся корзинки диаметром до 5 см, без цветоносов или с остатками цветоносов длиной не более 3 см. Обвертка серовато-зеленая, одно-, двухрядная; листочки ее линейные, заостренные, густоопушенные. Цветоложе слегка выпуклое, голое. Краевые цветки язычковые, длиной 15 – 28 мм, шириной 3 – 5 мм с изогнутой короткой опушенной трубкой, трехзубчатым отгибом, вдвое превышающим обвертку, и 4 – 5 жилками. Цветки расположены в 2 – 3 ряда у немахровых и в 10 – 15 рядов у махровых форм. Пестик с изогнутой нижней одногнездной завязью, тонким столбиком и двухлопастным рыльцем. Срединные цветки трубчатые с пятизубчатым венчиком. Изредка встречаются недозрелые плоды и их кусочки различной формы.

Цвет краевых цветков красновато-оранжевый, оранжевый, ярко- или бледно-желтый; срединных  оранжевый, желтовато-коричневый или желтый; незрелых плодов  зеленый, серовато-зеленый, желтовато-зеленый, желтовато-коричневый и коричневый. Запах слабый. Вкус водного извлечения солоновато-горький.

Измельченное сырье. Смесь кусочков цветоложа, язычковых, трубчатых цветков, листочков обвертки и их фрагментов, цветоносов, изредка кусочков недозрелых плодов проходящих сквозь сито с отверстиями размером 5 мм.

При просмотре под лупой (10×) или стереомикроскопом (16×) видны: кусочки цветоложа голые, часто с сохранившимися остатками обвертки по краю; язычковые цветки на верхушке трехзубчатые, обычно с оборванным трубчатым основанием; трубчатые цветки пятизубчатые, часто нераскрывшиеся (в виде бутонов); густоопушенные листочки обвертки серовато-зеленого цвета, узкие ланцетовидные с более светлой полосой по краю и слегка выступающей главной жилкой; цилиндрические кусочки цветоносов. Цвет язычковых цветков красновато-оранжевый, оранжевый, ярко-желтый или бледно-желтый; трубчатых цветков светло-желтый, желтый; листочков обвертки серовато-зеленый; незрелых плодов – зеленый, серовато-зеленый, желтовато-зеленый, желтовато-коричневый и коричневый; цветоложа – светло-серый, зеленовато- или коричневато-серый; цветоносов – серовато-зеленый.

Цвет измельченного сырья зеленовато-желтый с вкраплениями серовато-зеленого, красновато-оранжевого, оранжевого, светло-желтого, зеленого, желтовато-коричневого и коричневого цвета. Запах слабый. Вкус водного извлечения солоновато-горький.

Порошок. Смесь частиц ноготков цветков проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм.

При рассмотрении под лупой (10×) или стереомикроскопом (16×) видны: кусочки краевых язычковых цветков ланцетной формы с длинным отгибом, оранжевого или желтого цвета, с 3 зубчиками, с изогнутой коротко опушенной трубкой; цельные длинные (3 – 5 мм) трубчатые цветки, преимущественно их части, пятизубчатые, оранжево-желтого или желтого цвета; фрагменты сероватого цветоложа, кусочки густоопушенной обвертки зеленовато-серого цвета, с плотной темной срединной жилкой и пленчатым полупрозрачным краем, изредка кусочки плодов зеленого, серовато-зеленого, желтовато-зеленого, желтовато-коричневого и коричневого цвета; кусочки серовато-зеленых цветоносов.

Цвет порошка зеленовато-желтый с вкраплениями серовато-зеленого, красновато-оранжевого, оранжевого, светло-желтого, зеленого, желтовато-коричневого и коричневого цвета. Запах слабый. Вкус водного извлечения солоновато-горький.

Микроскопические признаки. Цельное, измельченное сырье. При рассмотрении микропрепарата язычковых цветков с поверхности должны быть видны удлиненные клетки эпидермиса с оранжевыми округлыми хромопластами и покрыты ярко выраженной кутикулой; с хорошо заметными мелкими друзами оксалата кальция в мезофилле цветка; на зубчиках эпидермис с сосочками, иногда с устьицами; трубка венчика густо опушена одно-, двухрядными волосками; завязь также опушена: с выпуклой стороны железистыми, по краям вогнутой стороны - простыми двухрядными волосками; фрагменты цветоложа с головчатыми волосками, их обломками или местами их прикрепления в виде 2 базальных тонкостенных клеток восьмеркообразной формы. Головка железистых волосков состоит из 2, 4 или 8 клеток. Эпидермис трубчатых цветков такой же, как у язычковых, но у зубчиков он с более вытянутыми сосочками; нижняя часть трубки венчика и завязь густо опушены одно-, двухрядными железистыми, реже двухрядными простыми волосками. Складчатость кутикулы, обычно маскируемая хромопластами, просматривается только на отдельных участках. Пыльца округлая и округло-трех-, четырехгранная шиповатая трех-четырехпоровая. Эпидермис листочков обвертки по краю представлен удлиненными клетками с прямыми стенками, в средней части - извилистыми стенками и устьицами, устьица аномоцитного типа; листочки обвертки густо опушены: по краю  длинными одно-, двухрядными простыми, двухрядными железистыми и ветвистыми волосками; в средней части  только железистыми волосками.

Порошок. При рассмотрении порошка должны быть видны: фрагменты эпидермиса язычковых и трубчатых цветков с удлиненными клетками и оранжевыми округлыми хромопластами; отдельные железистые волоски с двух-, четырех- или восьмиклеточной головкой и одно-, реже двухрядные простые волоски или их обломки; фрагменты тычиночных нитей, состоящих из почти квадратных клеток с утолщенными стенками; фрагменты эпидермиса густоопушенных листочков обвертки с прямыми или извилистыми стенками с устьицами и длинными одно-, двухрядными железистыми, простыми и ветвистыми волосками; мелкие друзы оксалата кальция в мезофилле; пыльца округлая и округло-трех-, четырехгранная шиповатая трех-четырехпоровая.

1,1 мл кислоты уксусной 1IV

Рисунок – Ноготков лекарственных цветки.

1 – фрагмент эпидермиса завязи трубчатого цветка: а – простой многоклеточный двухрядный волосок, б – двухрядные железистые волоски (200×); 2 – фрагмент эпидермиса завязи язычкового цветка: а – железистый двухрядный волосок, б – железистый однорядный волосок (200×); 3 – фрагмент эпидермиса листочка обвертки: а – устьица, б – 2-3-клеточные основания обломанных волосков (200×); 4 – фрагмент зубчика венчика трубчатого цветка: а – мелкие маслянистые капли в клетках мезофилла, б – сосочковидные выросты клеток эпидермиса (200×); 5 – фрагмент зубчика отгиба язычкового цветка: а – маслянистые капли в клетках мезофилла (200×); 6 – фрагмент отгиба язычкового цветка: а – маслянистые капли в клетках мезофилла, б – складчатость кутикулы эпидермиса (400×); 7 – округлые пыльцевые зерна с шиповатой экзиной и тремя порами (200×).

Определение основных групп биологически активных веществ

Тонкослойная хроматография

Приготовление растворов.

Раствор стандартного образца (СО) рутина. Около 0,005 г рутина (рутина тригидрата) растворяют в 10 мл спирта 96 %. Срок годности раствора не более 3 мес при хранении в прохладном, защищенном от света месте.

Раствор СО хлорогеновой кислоты. Около 0,001 г хлорогеновой кислоты растворяют в 10 мл спирта 96 %. Срок годности раствора не более 3 мес при хранении в прохладном, защищенном от света месте.

Раствор СО кофейной кислоты. Около 0,001 г кофейной кислоты растворяют в 10 мл спирта 96 %. Срок годности раствора не более 3 мес при хранении в прохладном, защищенном от света месте.

Раствор СО β-каротина. 0,02 г СО β-каротина растворяют в хлороформе в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора хлороформом до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

Дифенилборилоксиэтил-амина раствора 1 % в спирте 96 %. 1,0 г дифенилборилоксиэтиламина (дифенилборной кислоты аминоэтилового эфира) растворяют в 100 мл спирта 96 %. Срок годности раствора не более 3 мес при хранении в прохладном, защищенном от света месте.

Полиэтиленгликоля (ПЭГ) раствора 5 % в спирте 96 %. 5 мл полиэтиленгликоля (ПЭГ) 400 смешивают со 100 мл спирта 96 %. Срок годности раствора не более 6 мес при хранении в прохладном, защищенном от света месте.

Около 1,0 г сырья, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 10 мл спирта 70 %, нагревают с обратным холодильником на водяной бане в течение 30 мин. После охлаждения до комнатной температуры извлечение фильтруют через бумажный фильтр (испытуемый раствор).

На линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоем силикагеля на алюминиевой подложке размером 10 × 10 см в виде полос длиной 10 мм, шириной не более 3 мм наносят 20 мкл испытуемого раствора и параллельно в одну полосу 5 мкл раствора СО рутина и по 10 мкл растворов СО хлорогеновой и кофейной кислот. Пластинку с нанесенными пробами сушат при комнатной температуре в течение 5 мин, помещают в камеру, предварительно насыщенную не менее 30 мин смесью растворителей муравьиная кислота безводная ‑ вода ‑ этилацетат (10:10:80) и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 80 – 90 % длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей, выдерживают в сушильном шкафу при температуре 100 – 105 °С в течение 2 – 3 мин и еще теплую обрабатывают последовательно дифенилборилоксиэтиламина раствором 1 % в спирте 96 % и полиэтиленгликоля раствором 5 % в спирте 96 %. Через 30 мин после обработки пластинку просматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм.

На хроматограмме растворов СО рутина, СО хлорогеновой кислоты и СО кофейной кислоты должны обнаруживаться: флуоресцирующая зона желтого, желто-оранжевого или оранжевого цвета (рутин), флуоресцирующие зоны голубого цвета (хлорогеновая кислота и выше кофейная кислота).

На хроматограмме испытуемого раствора должны обнаруживаться следующие зоны адсорбции: две зоны с желтой, зелено-желтой или коричнево-желтой флуоресценцией (по рутину); две зоны с голубой флуоресценцией выше зоны рутина (по возрастанию холорогеновая кислота, затем кофейная кислота); допускается обнаружение дополнительных зон.

б) Около 1,0 г сырья, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, помещают в колбу вместимостью 50 мл, приливают 10 мл хлороформа, кипятят на водяной бане с обратным холодильником в течение 10 мин и охлаждают. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр и выпаривают на кипящей водяной бане до объема 1 мл (испытуемый раствор).

На линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоем силикагеля на алюминиевой подложке размером 10 × 15 см наносят 30 мкл испытуемого раствора и 20 мкл раствора СО β-каротина. Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе, помещают в хроматографическую камеру, предварительно насыщенную в течение 1 ч смесью растворителей гексан – бензол (85:15), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 80 – 90 % длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры и сушат до удаления следов растворителей (в вытяжном шкафу) после чего просматривают при дневном свете.

На хроматограмме испытуемого раствора должна обнаруживаться зона адсорбции темного цвета на уровне зоны адсорбции на хроматограмме раствора СО β-каротина; допускается обнаружение 2 дополнительных зон адсорбции желто-оранжевого цвета ниже зоны β-каротина и зоны адсорбции на старте.

К 2 мл раствора А испытуемого раствор (см. раздел «Количественное определение») приливают 1 мл воды, затем осторожно по стенке прибавляют 1 мл раствора ванилина в серной кислоте, на границе слоев должно наблюдаться образование окрашивания красновато-коричневого цвета в виде кольца (тритерпеновые соединения).

ИСПЫТАНИЯ

Влажность. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок  не более 14 %.

Зола общая. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок  не более 11 %.

Зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок  не более 5 %.

Измельченность сырья. Цельное сырье: частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм,  не более 5 %. Измельченное сырье: частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями размером 5 мм,  не более 5 %; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм,  не более 5 %. Порошок: частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм,  не более 5 %; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,18 мм,  не более 5 %.

Посторонние примеси

Остатки цветоносов, в том числе отделенные от корзинок при анализе. Цельное сырье  не более 6 %.

Корзинки с полностью осыпавшимися язычковыми и трубчатыми цветками (цветоложе с обвертками). Цельное сырье  не более 20 %.

Сырье, изменившее окраску (потемневшее и почерневшее). Цельное сырье, измельченное сырье  не более 3 %.

Другие части растения (кусочки стеблей, листьев). Цельное сырье, измельченное сырье  не более 3 %.

Органическая примесь. Цельное сырье, измельченное сырье  не более 0,5 %.

Минеральная примесь. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок  не более 0,5 %.

Тяжелые металлы . В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».

Радионуклиды. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания радионуклидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».

Остаточные количества пестицидов . В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания остаточных пестицидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».

Микробиологическая чистота. В соответствии с требованиями ОФС «Микробиологическая чистота».

Количественное определение. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок: суммы флавоноидов в пересчете на рутин,  не менее 1 %; экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом 70 %,  не менее 35 %; экстрактивных веществ, извлекаемых водой,  не менее 35 %.

Сумма флавоноидов

Приготовление растворов.

Раствор СО рутина. Около 0,05 г (точная навеска) рутина, предварительно высушенного при 130 – 135 °С в течение 3 ч, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяют при нагревании на кипящей водяной бане в 85 мл спирта 96 %, охлаждают, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают (раствор А СО рутина). Срок годности раствора не более 30 сут при хранении в прохладном, защищенном от света месте.

1,0 мл раствора А СО рутина, 0,1 мл уксусной кислоты, 5 мл алюминия хлорида спиртового раствора 2 %, помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят спиртом 96 % до метки (раствор Б СО рутина). Срок годности раствора не более 30 сут при хранении в прохладном, защищенном от света месте.

Аналитическую пробу сырья измельчают до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл спирта 70 %, колбу закрывают пробкой, взвешивают с погрешностью ± 0,01 г и оставляют на 1 ч. Затем колбу присоединяют к обратному холодильнику, нагревают на кипящей водяной бане, поддерживая слабое кипение в течение 2 ч. После охлаждения колбу с содержимым вновь закрывают той же пробкой, взвешивают и содержимое колбы при необходимости восполняют растворителем. Содержимое колбы тщательно взбалтывают и фильтруют через сухой бумажный фильтр, отбрасывая первые 20 мл, в сухую колбу вместимостью 200 мл (раствор А испытуемого раствора).

1,0 мл раствора А испытуемого раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл алюминия хлорида спиртового раствора 2 % и 0,1 мл уксусной кислоты, доводят объем раствора спиртом 96 % до метки и перемешивают (раствор Б испытуемый раствор).

Оптическую плотность раствора Б испытуемого раствора измеряют через 40 мин на спектрофотометре при длине волны 408 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А испытуемого раствора, 0,1 мл уксусной кислоты, доведенный спиртом 96 % до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора Б СО рутина в таких же условиях. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1,0 мл раствора А СО рутина, 0,1 мл уксусной кислоты раствора, доведенный спиртом 96 % до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

где А

А о  оптическая плотность раствора Б СО рутина;

а – навеска сырья, г;

а о  навеска СО рутина, г;

Р – содержание основного вещества в СО рутина, %;

W  влажность сырья, %.

Допускается содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин вычислять с использованием удельного показателя поглощения комплекса рутина с алюминия хлоридом по формуле:

где А  оптическая плотность раствора Б испытуемого раствора;

удельный показатель поглощения комплекса рутина с

алюминия хлоридом при длине волны 408 нм, равный 248;

а – навеска сырья, г;

W  влажность сырья, %.

Экстрактивные вещества . В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» (метод 1, экстрагенты – вода очищенная, спирт 70 %).

Примечание. Определение суммы флавоноидов и экстрактивных веществ, извлекаемых водой, проводят для сырья, предназначенного для производства лекарственных растительных препаратов (пачки, фильтр-пакеты); определение суммы флавоноидов и экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом 70 % проводят для сырья, предназначенного для производства настойки.

Упаковка, маркировка и транспортирование . В соответствии с требованиями ОФС «Упаковка, маркировка и транспортирование лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов».

Хранение. В соответствии с требованиями ОФС «Хранение лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов».

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Фитохимическое исследование по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе календулы лекарственной

На правах рукописи

ШАРОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПО СТАВДАРТИЗАЦИИ И СОЗДАНИЮ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ КАЛЕНДУЛЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Самара-2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, профессор Куркин Владимир Александрович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Шатапаев Иван Федорович доктор фармацевтических наук, профессор Дмитрук Степан Евгеньевич

Ведущее учреждение ~ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

На заседании диссертационного совета К 208 085 03

При ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава»

(443 079, г Самара, проспект К Маркса, 165 Б)

С диссертационной работой можно ознакомиться В библиотеке ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (Самара, ул Арцыбушевская, 171).

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Защита состоится «_

Кандидат фармацевтических наук

EJB. Авдеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Препараты календулы лекарственной, или ноготков лекарственных (Calendula officinalis L.) успешно используются в аллопатической и гомеопатической медицине как средства обладающие ранозаживляющими, противовоспалительными, регенерирующими, желчегонными и отхаркивающими свойствами Календула широко культивируется в Российской Федерации, а Самарская область является регионом, где сосредоточена самая крупная сырьевая база календулы лекарственной (СГПУ «Сергиевский», ЗАО «Самаралектравы» и ООО «Кентавр»)

В настоящее время цветки календулы лекарственной используются в отечественной медицинской практике в виде настойки (МО на 70% этиловом спирте), экстракта жидкого (1:2 на 40% этиловом спирте), масляного экстракта, мази, суппозиторий, входят в состав комплексных препаратов. Ротокан, Витаон, Алором, Венен гель, сбор желчегонный №3, сбор грудной №4 и др.

Широкий спектр фармакологического действия цветков календулы обусловлен содержанием различных классов биологически активных соединений (БАС). К ведущей группе БАС относятся витамины, а именно" каротиноиды Установлено, что содержание каротиноидов в сырье коррелирует со степенью махровости соцветий, а также зависит от способа сушки и условий хранения, однако анализ цветков календулы на содержание каротиноидов в НД не предусмотрен. Вторая группа

биологически активных соединений представлена флавоноидами, однако данные по компонентному составу являются противоречивыми

Фотохимические аспекты показателей качества в случае сырья и препаратов данного растения, также нуждаются в дальнейшем изучении, поскольку в Фармакопейной статье (ФС) 5 ГФ СССР XI издания на цветки календулы лекарственной отсутствуют разделы «Качественные реакции» и «Количественное определение», а содержание действующих веществ оценивается лишь косвенно по показателю «экстрактивных веществ, извлекаемых 70% этиловым спиртом, «не менее 35%»

Решение вопросов стандартизации новых лекарственных средств (ЛС) связано с разработкой объективных и унифицированных методов анализа сырья и препаратов (Арзамасцев А П. и др, 2000; Самылина И.А. и др, 1994)

Актуальна также задача по оптимизации состава и технологии препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий На наш взгляд, повышение в лекарственной форме уровня содержания действующих веществ приведет к усилению антимикробной и противовоспалительной активности

Цель и задачи исследования. Проведение изучения химического состава цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области, а также разработка унифицированных методик стандартизации сырья и препаратов на основе данного растения

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

1 Изучение химического состава цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области

2 Разработка новых подходов к стандартизации сырья и препаратов календулы лекарственной, с учетом принципа унификации методик в

ряду лекарственное растительное сырье - субстанция - лекарственная форма.

3 Разработка методик качественного анализа цветков календулы лекарственной

4. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в цветках календулы лекарственной

5 Разработка методики количественного определения суммы каротиноидов в цветках календулы лекарственной

6 Разработка методик качественного и количественного анализа препаратов «Календулы настойка», «Календулы экстракт жидкий».

7 Оптимизация состава и технологии получения лекарственных препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий»

8 Разработка и изучение числовых показателей препаратов. «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий».

9 Разработка и оформление нормативной документации (НД) на сырье «Ноготков цветки», а также препараты «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий»

Научная новизна. В результате изучения химического состава цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области, выделены и идентифицированы 7 индивидуальных соединений, среди которых доминирующее флавоноидное вещество (нарциссин) выделено впервые в РФ из данного растения и идентифицировано с использованием УФ-, "Н-ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии и различных химических превращений (кислотный и ферментативный гидролиз)

Показана целесообразность проведения стандартизации сырья и препаратов календулы лекарственной по каротиноидам (ведущая группа БАС) и флавоноидам

Научно обоснована целесообразность оптимизации состава и технологии получения лекарственных средств «Календулы экстракт жидкий» и «Календулы настойка», обладающих более высокой противомикробной активностью

Практическая значимость:

1 Разработаны методики качественного и количественного анализа цветков календулы лекарственной в проект ФС «Ноготков цветки» предложено ввести новые разделы «Качественные реакции» и «Количественное определение» и числовой показатель «Содержание суммы флавоноидов не менее 1,0%»

2 Разработаны методики качественного и количественного анализа препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий» с использованием ТСХ-анализа и спекгрофотометрии.

3 Определены числовые показатели препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий» содержание суммы флавоноидов, сухой остаток, концентрация спирта, экстрактивные вещества

4 Обоснована целесообразность применения разработанных препаратов цветков календулы лекарственной «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий» в медицинской практике в качестве средств обладающих противомикробными свойствами.

5 Оформлены и направлены в Фармакопейный государственный комитет Министерства здравоохранения и социального развития РФ Изменения №1 к ФС 5 и проект ФС «Ноготков цветки» для включения в Российскую Государственную Фармакопею ХП издания

6 Разработаны проекты ФС на препараты «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий», для которых оптимизированы состав и технология получения 7. Результаты исследований используются в научных изысканиях и в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета (акты внедрения от №1 и №2 от 4.09.2007 г.).

1. Результаты изучения химического состава цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области

2 Данные результатов исследований по разработке методов стандартизации сырья и препаратов календулы лекарственной.

3 Методики качественного и количественного анализа лекарственного растительного сырья (ЛРС) «Ноготков цветки» и препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий» с использованием ГСО рутина

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Самарского государственного медицинского университета (№ Государственной регистрации 01200105332) и Республиканских программ

1 «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме-«Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277).

2 «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536).

Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на П Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи, 2005 г.), на X и XI Всероссийском конгрессе "Экология и здоровье человека" (Самара, 2005; 2006 гг); на Межвузовской конференции «Аспирантские чтения» (Самара, 2005, 2006 гг), на конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета БГМУ (Уфа, 2006 г), на 62-й Межрегиональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2007 г), на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора ЛН Березнеговской «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006 г.); на V международной конференции «Медико-социальная экология личности состояние и перспективы» (Минск, 2007 г), на ХП Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007 г), на Ш Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007 г), на XIV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1620 апреля 2007 г)

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 23 рисунка Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4-х глав, отражающих результаты собственных

экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 198 источника, из которых 60 на иностранных языках

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований календулы лекарственной, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава растения, фармакологической активности, применению в медицинской практике

В главе 2 представлены характеристика объектов и методов исследования Приведены методики химического, физического и физико-химического изучения лекарственного сырья, индивидуальных веществ и препаратов, а также методы контроля качества лекарственных форм на основе цветков календулы лекарственной

В главах 3-6 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по изучению химического состава цветков календулы лекарственной, совершенствованию методов стандартизации данного сырья и препаратов на его основе, оптимизации состава и технологии получения, оценке их качества и обоснованию целесообразности внедрения в медицинскую практику в качестве антимикробных и противовоспалительных лекарственных средств

В приложение вынесены материалы по разработке нормативной документации и акты внедрения результатов исследований

1. Микроскопический анализ соцветий календулы лекарственной

Анатомические исследования соцветий календулы лекарственной сорта «Кальта» проводили с использованием микроскопа «Биолам» с увеличением х184,8, х924, х1344

Микроскопический анализ цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области показал, что диагностическое значение для данного вида сырья имеют- наличие хромопластов в клетках эпидермиса, форма клеток эпидермиса, строение, вид и расположение волосков трубчатых и язычковых цветков, а также листочков обертки Немалое диагностическое значение играет и пыльца календулы лекарственной Результаты проведенного исследования подтверждаются соответствующими микрофотографиями.

2. Изучение химического состава цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области

В результате изучения химического состава цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области, выделены 7 индивидуальных веществ относящихся к фенольным соединениям (1-4), каротиноидам (5), сапонинам (6) и стеринам (7) (табл. 1)

Препаративное разделение веществ осуществляли методом адсорбционной колоночной хроматографии Для элюирования использовали смеси растворителей, а именно: хлороформ-спирт в различных соотношениях. Эффективное разделение и очистка веществ достигалась чередованием сорбентов (силикагель, полиамвд) и соответствующих систем растворителей. Кристаллизацию и перекристаллизацию веществ осуществляли с использованием гексана,

хлороформа, этилового спирта и воды. Отсутствие примесей в полученных соединениях контролировали методом ТСХ в нескольких системах с использованием различных способов детекции

Для установления структуры выделенных веществ использовали данные УФ-, "Н-ЯМР- и масс-спектров, а также результаты химических превращений ЯМР- и УФ-спектры выделенного диагностического флавоноида цветков календулы - нарциссина представлены на рисунках 1 и 2 соответственно

"Н-ЯМР-спектр нарциссина в смеси дейтероацетона и D20 (200 МГц) (Gemmmi 200) 8 (м д) 7,97 (д, 2 Гц, Н"-2), 7,66 (дд, 2 и 8,5 Гц, Н"-6), 6,96 (д, 2 Гц, Н"-5), 6,50 (д, 2 Гц, Н"-8), 6,24 (д, 2 Гц, Н-6), 5,23 (д, 7 Гц, Ни-1 глюкопиранозы), 4,50 (д, 2 Гц, НИ1-1 рамнопиранозы), 3,95 (с, ЗН, СНэО), 3,2-3,8 (10 Н Сахаров), 1,04 (д, 6 Гц, СН3 рамнозы) (рис 1,2) Нарциссин гидролизуется ферментом рамнодиастазой, что позволяет сделать вывод о наличии в данном гликозиде биозы рутинозы. При кислотном гидролизе расщепляется на глюкозу, рамнозу и агликон, идентифицированный как 3,5,7,4"-тетрагидрокси-3"-метоксифлавон (изорамнетин) УФ-спектры с диагностическими реагентами свидетельствуют о гликозилировании 3-ОН-группы изорамнетина

Следовательно, выделенное соединение является З-О-рутинозидом изорамнетина (нарциссин).

Соединения выделенные, в ходе проведения фитохимического исследования цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области, представлены в таблице 1

Установлено, что нарциссин является доминирующим и диагностическим флавоноидом впервые и выделенным в РФ из цветков календулы лекарственной.

Pue. 1. JIMP-cnerrp 3-0-p>thho3h4 n3opaMHeTHHa b ^ettTCpoanerOHe (+D20).

PHC. 2. y-cneKTp HapnwccHna

Таблица 1

Физико-химические константы соединений, выделенных из цветков календулы лекарственной

№ Название, химическая формула Состав У? Т.пл °С С(ЕЮН), нм

1. Нарциссин рсч, TXJP™ ^Ч^у-Шит С28Н32О16 316 173175° 257,268пл, 367 нм

2. Изокверцитрин он о C21H20OU 302 227229° 256,267пл, 370 нм

3 Кофейная кислота С9Н8О4 180 218221° 235,242, 326

4 Хлорогеновая кислота он CieHjeOp 203205° 243,300 пл, 330

5 Р-каротин НзС- ХЦ, ?"» Нз^Х^

6. Олеаноловая кислота СзоНдаОз т пл. 304307°

7. Р-ситостерин С29Н50 О т пл 135137°

3. Совершенствование методов стандартизации сырья «Ноготков цветки»

Согласно современным требованиям (НД) на ЛРС, фотохимический анализ включает задачи качественного и количественного анализа ЛРС по содержанию ведущих групп БАС, обеспечивающих фармакологическую активность.

Так, в нормативной документации на сырье «Ноготков цветки» отсутствуют разделы «Качественные реакции» и «Количественное определение» и, следовательно, для целей идентификации сырья не используются химические диагностические признаки В этом отношении особый интерес представляет тонкослойная хроматография, которая в последнее время все более широко используется в методиках качественного анализа

Учитывая высокое содержание флавоноидов в цветках календулы лекарственной, их несомненную значимость в проявлении биологической активности данного сырья, представляется целесообразным проведение исследований в плане обоснования возможности стандартизации данного ЛРС по содержанию флавоноидов

Необходимость во внесении изменений в ФС «Ноготков цветки» (ст. 5 ГФ XI издания) объясняется в данном случае отсутствием разделов: «Качественные реакции» и «Количественное определение».

Кроме того, в литературе описаны методики определения подлинности сырья «Ноготков цветки» путем обнаружения рутина, однако, по результатам проведенных нами исследований данное соединение в соцветиях календулы лекарственной не обнаружено, что говорит о нецелесообразности данного подхода

В этой связи, нами предложены новые подходы к стандартизации, заключающиеся в обнаружении доминирующего и диагностического флавоноида нарциссина в присутствии ГСО рутина (качественные реакции), а также определение суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии

Рис. 3. ТСХ-анализ извлечений цветков календулы лекарственной

(«Силуфол УФ -254», система растворителей: хлороформ - метиловый спирт -вода (26 14:3). Обозначения

1 Государственный стандартный образец рутина

3. Рабочий стандартный образец Р-каротина

4. Извлечение на 40% этиловом спирте из цветков календулы лекарственной

5 Извлечение на 70% этиловом спирте из цветков календулы лекарственной.

3.1. Качественный анализ цветков календулы лекарственной

С целью определения подлинности сырья «Ноготков цветки» использовали ТСХ-анализ (рис 3), основанный на обнаружении и идентификации доминирующего флавоноида (нарциссин), и качественные реакции

В ходе разработки методики были проведены исследования по выбору оптимальных условий хроматографирования, позволяющие эффективно разделить основные компоненты сырья и однозначно идентифицировать доминирующее БАС-нарциссин.

В результате проведенных опытов с различными хроматографическими системами (хлороформ-этанол, хлороформ-метанол, хлороформ-метанол-вода в различных соотношениях) предпочтение было отдано системе растворителей хлороформ-метанол-вода (2614.3), обеспечивающей наиболее четкое разделение флавоноидов, в том числе и доминирующего компонента - З-О-рутинозид изорамнетина При просмотре хроматограммы в УФ-свете при длине 254 нм З-О-рутинозид изорамнетина обнаруживается в виде доминирующего пятна с ярко-фиолетовой флуоресценцией (Ь^ около 0,5) (рис 3).

На наш взгляд, в данной методике целесообразно использовать ГСО рутина, по физико-химическим свойствам близкий к нарцисеину, так как расчет величины ^ позволит повысить объективность методики для анализируемого вещества

Учитывая разнообразие БАС цветков календулы, целесообразно также определять в сырье наличие (3-каротина и тритерпеновых сапонинов

Для качественного анализа предлагается использовать также данные УФ-спектра водно-спиртового извлечения цветков календулы лекарственной имеющий полосы поглощения с максимумами при 256±2 нм (флавоноиды) и «плечо» в области около 330-350 нм (флавоноиды+гидроксикоричные кислоты) (рис 4).

Исходя из полученных данных можно с уверенностью сказать, что выделенный впервые в РФ, из цветков календулы лекарственной диагностический флавоноид (нарциссин), достаточно объективно характеризует данное сырье.

Рис. 4. УФ-спектры растворов извлечений из цветков календулы

лекарственной.

Обозначения:

1 - раствор извлечения (1:30) из цветков календулы

лекарственной;

2 - раствор извлечения (1:30) из цветков календулы

лекарственной с добавлением алюминия хлорида;

3 - раствор извлечения (1:30) из цветков календулы

лекарственной с добавлением алюминия хлорида (дифференциальный спектр)

ДпиниН0ЛН

3.2. Количественный анализ цветков календулы лекарственной

В основу предложенной нами методики количественного анализа БАС цветков календулы лекарственной предложено дифференциальное спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин

С целью разработки методики количественного определения суммы флавоноидов нами определены оптимальные условия экстракции цветков календулы лекарственной экстрагент 70% этанол; соотношение сырье-экстрагент - 1-30, время экстракции - извлечение на водяной бане при температуре 85-90 °С в течение 60 мин

При разработке методики количественного определения суммы флавоноидов использовали реакцию комплексообразования с раствором алюминия хлорида для исключения вклада в значение оптической плотности других групп соединений В этом случае наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов, который обнаруживается в УФ-спектре в виде максимума поглощения при длине волны 408 нм. Это находит подтверждение в условиях дифференциальной спектрофотометрии. максимум поглощения при 412 нм (рис 4)

Изучение УФ-спектров ГСО рутина показало, что раствор данного стандарта в присутствии алюминия хлорида имеет тот же максимум поглощения (412 нм). Следовательно, рутин может быть использован в методике анализа в качестве ГСО

Метрологические характеристики методики количественного определения флавоноидов в сырье «Ноготков цветки», рассчитаны из результатов анализа одного образца данного сырья в 11 независимых измерениях (табл 2)

\1cipo 101 нче«.кии хараккриники мсшшьн 1м>.аш2

ко.жчссшенною »¡¡ре имения пммы ф мнинои юн н циспчач ка.юп 1\.1Ы.к-каровс-ннои

/ X 5 Р, % ЦР£ АХ Е, %

1(1 IV) МИНУ 2 2? 0,1)41 \ Н)

Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы флавоноидов в цветках календулы лекарственной с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,40%. Опыты с добавками ГСО рутина в извлечение из цветков календулы свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки

Следует отметить, что цельное и измельченное сырье, на котором проводилась отработка по показателю качества «содержание суммы флавоноидов», соответствовало требованиям ФС 5 ГФ XI издания по внешнему виду, микроскопическим и числовым показателям

4. Совершенствование методов стандартизации препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий»

При разработке подходов к решению проблем стандартизации препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий» мы придерживались принципа унификации методик анализа в ряду лекарственное растительное сырье-субстанция-лекарственная форма (И.А. Самылина, 1994,1995 г).

Для качественного анализа препаратов данного растения, как и случае сырья, предложен метод ТСХ-анализа с использованием ГСО рутина, а также идентификация по параметрам УФ-спектра.

Рис. 5. ТСХ-анализ препаратов календулы лекарственвой

(«Силуфол УФ -254», система растворителей хлороформ - метиловый спирт пода. (26-14 3) Обозначения:

1 Государственный стандартный образец рутина.

2 Рабочий стандартный образец нарциссина

3. Рабочий стандартный образец (3-каротина

4. Настойка (1 5) на 70% этиловом спирте го цветков календулы лекарственной

5. Экстракт (1 2) на 70% этиловом спирте из цветков календулы лекарственной

При просмотре хроматограммы в УФ-свете при длине волны 254 нм обнаруживается доминирующее пятно с фиолетовой флуоресценцией-величина около 0,5 (нарциссин) (рис 5) На хроматограмме извлечения возможно обнаружение также других веществ - изокверцитрина (пятно с фиолетовой флуоресценцией), а также р-каротин с величиной Ь^ около 0,9 (пятно желтого цвета) Допускается также наличие других пятен с величиной около 0,8 (кофейная кислота) и 0,2 (хлорогеновая кислота) Также для качественного анализа предлагается использовать данные УФ-спектра водно-спиртового извлечения цветков календулы лекарственной с характерным максимумом при 256±2 нм (флавоноиды) и «плечом» в области 330 -350 нм (флавоноиды+гидкроксикоричные кислоты)

В основу количественного определения суммы флавоноидов в настойке и экстракте календулы лекарственной, как в случае сырья положен метод дифференциальной спектрофотометрии Определение

суммы флавоноидов осуществляют в пересчете на рутин, как это предусмотрено и в проекте ФС 42- (взамен ФС 5 ГФ СССР XI издания)

УФ-спектр спиртовых растворов препаратов, в частности экстракта (рис. 6) имеет характерный максимум при Хтоах=256±2 нм (флавоноиды) и «плечом» в области 330-350 нм (флавоноиды+гидроксикоричные кислоты). Поскольку, ранее было обосновано что, оценку качества сырья целесообразно проводить по содержанию флавоноидов, аналитическая длина волны составляет - 412 нм. В данной области спектра спиртовые растворы препаратов и флавоноиды (нарциссин) имеют прямопропорциональную зависимость оптической плотности от концентрации Данное обстоятельство позволяет использовать спектрофотометрию для количественного определения флавоноидов в пересчета на рутин

Метрологические характеристики методики количественного анализа суммы флавоноидов в препарате «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий» представлены в табл 4 ,5

Mci po.ioi ii"ii"iкко \/<; 4

KO.III"Kllltl-IfllOIl) Ulipciv.li.llllll оччы ф.ышикш l»lt u

IIUCMIHKI KM.II II 14.11.1 .U"K.ipcillt IIIIOII

_ __ _ __ __ _ _____

10 0,3 J 0,(X)51 95 2.23 0,01147 3,70

Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет 3,70% Опыты с добавками ГСО рутина в препарат и в раствор А показали, что относительная ошибка находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки методики

М(.1|10.1<)1ИЧССкИС \jpdk-UpifC1liKI1 М(1Л1ИКИ ГчШЧЧ I

КО 1ИМСС1ВСПШН О (Игр*. К И"ИИИ 1>ММ1.1 ф.ЫН(1ИОИ ШП II

жирдк-ю кален 1>.1м ¡екарсшеннои

7 т Т7РЪ лх I

10 очл (I ()| ч«. :.■« оогыч

Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет 4,65% (табл. 5); ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки методики (опыты с добавками).

С учетом результатов проведенных исследований возникла необходимость в пересмотре некоторых разделов имеющейся НД на цветки календулы лекарственной и препараты «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий».

5. Обоснование использования разработанных препаратов в медицинской практике

Цветки календулы лекарственной являются перспективным источником для получения лекарственных средств, обладающих, антимикробных, противовоспалительных, ускоряющих регенерацию лекарственных средств Большие ресурсы и доступность сырья, обширные сведения народной медицины, широкий спектр терапевтического действия делают календулу перспективным объектом исследования.

Достаточного широкий спектр терапевтического действия препаратов календулы лекарственной объясняется высоким содержание действующих веществ (флавоноиды, каротиноиды, тритерпеновые сапонины).

С использованием разработанных методик анализа нами оптимизированы состав и технология получения лекарственных средств «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий».

В усовершенствованных лекарственных средствах («Календулы настойка» в соотношении 1 5 вместо соотношения 1 10 и «Календулы экстракт жидкий» на 70% этиловом спирте, вместо 40% этилового спирта) обосновано более высокое содержание биологически активных соединений - каротиноидов и флавоноидов (соответственно в 1,2 и 1,5 раза) Разработанные препараты «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий» превосходят в 2 раза по антимикробной активности образцы промышленных аналогов.

1 В результате изучения химического состава цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области, выделены 7 индивидуальных веществ, относящихся к фенольным соединениям (14), каротиноидам (5), сапонинам (6) и стерлиам (7).

2 Выделенные вещества идентифицированы с помощью УФ-, "Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, а также различных химических превращений как нарциссин, изокверцитин, кофейная кислота, хлорогеновая кислота, Р-каротин, олеаноловая кислота и р-ситостерин.

3 Установлено, что доминирующий диагностический флавоноид цветков календулы лекарственной нарциссин (З-О-рутшюзид изорамнетина) выделен впервые в РФ из сырья данного растения

4 Показана целесообразность проведения стандартизации сырья и препаратов цветков календулы лекарственной по содержанию суммы флавоноидов (количественное определение) и по содержанию доминирующего флавоноида нарциссина (качественные реакции)

5 Разработаны методики качественного ТСХ-анализа цветков календулы лекарственной, основанные на обнаружении нарциссина, а также на определении параметров УФ-спектра

6 Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутина с использованием дифференциальной спектрофотометрии. Ошибка единичного

определения содержания суммы флавоноидов с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,40%

8 Обосновано включение в проект ФС «Ноготков цветки» дополнения к разделу «Качественные реакции» и введение нового раздела «Количественное определение» с регламентацией числового показателя «Сумма флавоноидов в пересчете на рутин не менее 1%.

9. Осуществлена оптимизация состава и способа получения лекарственных средств «Календулы настойка» (Г5) и «Календулы экстракт жидкий» (1:2) с использованием в обоих случаях в качестве экстрагента 70% этилового спирта

Ю.Разработаны методики качественного и количественного анализа препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий» с использованием ТСХ и дифференциальной спектрофотометрии Ошибка единичного определения содержания суммы флавоноидов в настойке и экстракте с помощью разработанных методик с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,65% и ±4,70% соответственно

11. Определены числовые показатели препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий» содержание суммы флавоноидов, сухой остаток, содержание спирта, В качестве нижнего предела содержания суммы флавоновдов, в пересчете на рутин, в настойке и экстракте рекомендованы показатели 0,2% и 0,4%, соответственно.

12.На основании экспериментальных данных, полученных в ходе химического изучения и анализа различных образцов цветков календулы лекарственной (Calendula officinalis L.), оформлены Изменения №1 к ст. 5 (ГФ XI) и проект ФС «Ноготков цветки» для включения в Российскую Государственную Фармакопею XII издания

13.Разработаны проекты ФСП «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий», лекарственные средства на основе цветков календулы, обладающие более выраженной антимикробной активностью по сравнению с соответствующими промышленными аналогами.

1. Шарова, О В Хроматографическое исследование препаратов на основе цветков календулы лекарственной / О В Шарова // Аспирантский вестник Поволжья Тез. докл. №1, 2005 г. - Самара, 2005.- С. 109.

2. Браславский, В.Б. Перспективы использования антибактериальных растительных средств в медицинской практике. / В Б Браславский, О Е. Правдивцева, А.В. Куркина, В В Стеняева, А И Бонцевич, О В Шарова, Е С Артамонова, В М Рыжов // Экология и здоровье человека Труды X Всероссийского конгресса, Самара 11-13 октября 2005 г - Самара, 2005. - С 42-43

3. Куркин, В.А Современные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды / В А. Куркин, Г Г Запесочная, В Б. Браславский, Е В Авдеева, О Е Правдивцева, А В Супильникова, В В Стеняева, М.В Егоров, А.И. Бонцевич, О В Шарова / П Всероссийский съезд фармацевтических работников. Материалы съезда, Сочи, 5-7 июня 2005 г. - Сочи, 2005 - С 95-96.

4. Шарова О.В. Фитохимическое исследование сырья и препаратов на основе цветков календулы лекарственной / О.В Шарова, В А Куркин // Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.Н Березнеговской, Томск, 11-12 сентября 2006. - Томск, 2006 -С 370-372.

5. Шарова, О В Фармакогностическое исследование цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области / О В Шарова // Медицинский вестник Башкортостана Специальный выпуск посвящен 25-летию фарм. ф-та БГМУ. - 2006 -№ 1 - С 181-184

6. Шарова О.В Проблемы создания и стандартизации сырья и препаратов календулы лекарственной / О В Шарова // Экология и здоровье человека Проблемы выживания человека в техногенной среде современных городов: Труды XI Всероссийского конгресса, Самара, 5-7 декабря 2006 г - Самара, 2006 - С 18-19.

7. Шарова, О В Фитохимическое исследование сырья и препаратов на основе цветков календулы лекарственной / О В Шарова // Аспирантские чтения: Материалы межвуз конф. молодых ученых -Самара, 2006 - 284-287

8. Куркин, В.А. Флавоноиды цветков Calendula officinalis / В.А. Куркин, О.В Шарова Н Химия природ, соединений. - 2007. - № 2 С. 179-180

9. Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб науч. тр. / под ред. Е.Н. Вергейчика, Н Н. Кареевой / Пятигорская ГФА, Санкт-Петербургская ГХФА - Пятигорск, 2007. -С 416-420.

10. Куркин, В.А. Актуальные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды / В А. Куркин, Е В. Авдеева, В.Б Браславский, О.Е Правдивцева, А В. Куркина, М В. Егоров, О В Шарова, Е С Артамонова, В.М Рыжов, Ламрини Мохаммед // Человек и лекарство: Тез. докл XIV Рос. нац конгр, Москва, 16-20 апр 2007 г. - М., 2007 - С. 839

11. Шарова, О В Проблемы стандартизации сырья «Ноготков цветки» / О.В Шарова // Молодые ученые в медицине. Тез докл ХП Всероссийской научно-практической конф., Казань, 25-26 апр 2007 -Казань,2007 -С.270-271

12. Шарова, О В Фитохимическое исследование сырья «Ноготков цветки» / О В. Шарова, В.А. Куркин // Медико-социальная экология личности- состояние и перспективы. Материалы V Международной конф, Минск, 6-7 апр. 2007. - Минск, 2007. - С. 345-347

13. Шарова, О.В Современные подходы к стандартизации сырья «Ноготков цветки» / О.В. Шарова // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: Материалы Ш Всероссийской конф., книга 2. - Барнаул, 2007. - С 245-249.

14. Шарова, О.В Флавоноиды цветков календулы лекарственной / О.В Шарова, В.А. Куркин // Химия растительного сырья - 2007. №1. С 65-68

Подписано в печать 19 09.2007 Формат 60x84/16. Бумага офсетная Печать оперативная Уел печ л 1,63 Тираж 100 экз Заказ 973

Отпечатано в типографии ООО «ОФОРТ» 443080, г Самара, ул Революционная, 70, литера П Тел. 372-00-56,372-00-57